Экспресс-анализ бактерий рода Salmonella

Сальмонеллез относится к числу убиквитарных зооантропонозов, экономический ущерб от которого складывается из падежа заболевшего молодняка, отставания в росте и развитии переболевшего поголовья.

Проблема профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, в том числе и птицы, для отечественных хозяйств имеет экономическое и социальное значение. Причину заболеваний ветеринары связывают с поражением продуктов питания животного происхождения патогенными микроорганизмами. Адаптация штамма Salmonella enteritidis к организму птицы, повышение его устойчивости создали предпосылки для передачи возбудителя от птицы к человеку и обратно. По данным Всемирной организации здравоохранения заболеваемость людей сальмонеллезом за последнее десятилетие возросла в шесть раз, а на постсоветском пространстве в семь раз. При этом этиологическая значимость S. enteritidis в заболевании людей возросла на треть, животных на три четверти, а число случаев обнаружения возбудителя в продуктах питания увеличилось на половину. Поэтому обязательный микробиологический контроль бактерии рода Salmonella должен проводиться в кратчайшие после изготовления сроки. Классические методы анализа обычно занимают несколько суток, что создает риски для производителей пищевой продукции, особенно это касается скоропортящихся продуктов. В статье подобраны несколько ускоренных методов выявления бактерий сальмонеллеза, которые помогут провести исследование в максимально короткие сроки.

Ускоренные методы выявления бактерий

Один из ускоренных методов выявления бактерий рода Salmonella считается метод с использованием среды Раппопорта– Вассилиадиса (среда MSRV) с новобиоцином.

Полужидкая среда MSRV официально рекомендована для ускоренного выявления сальмонелл. Принцип селективного определения этих бактерий на среде MSRV- это выявление подвижности сальмонелл в полужидкой среде и образование ими светлой непрозрачной зоны роста - феномен роения. Рост сопутствующих бактерий ингибируется введением новобиоцина, присутствием хлорида магния, малахитового зеленого и инкубацией при повышенной температуре – 41,5 °С.

Отсутствие этапа селективного обогащения сокращает общее время исследования на 24-48 часов. После предварительного обогащения исследуемый образец (0,1 куб.см) добавляют в центр чашки Петри со средой MSRV (или по 0,03 куб.см в 3 местах на чашке Петри). Посев инкубируют крышкой вверх при 41,5±1 °С в течение 12-18 часов в аэробных условиях. При наличии сальмонелл в анализируемом образце вокруг места посева отмечается диффузный рост колоний подвижных штаммов сальмонеллы в толще этой среды (от центра к периферии), окруженных светлым ореолом – зоной подвижности колоний . С края зоны подвижности колоний берут материал для пересева на дифференциально-диагностические среды. При наличии на среде MSRV роста колоний в форме пуговки проводят их биохимическую идентификацию на возможную причастность к неподвижным сальмонеллам (S.pullorum, S. gallinarum). Преимущества этого метода в том, что за счет совмещения этапа селективного обогащения с этапом высева на агаризованную среду сокращается время исследования на 24-48 часов. Этот экономичный метод обладает высокой чувствительностью, обеспечивающей выявление даже единичных клеток сальмонелл. Ускоренный метод выявления бактерий рода Salmonella с использованием среды Salmosyst, двухкомпонентная среда которого официально рекомендована для применения в лабораториях. Первый этап включает неселективное обогащение имеющихся в образце бактерий на среде Salmosyst® Broth Base , инкубирование которых происходит при 35 °С в течение 6-8 ч. По окончании 1-го этапа к 10 куб. см среды добавляют 1 таблетку Salmosyst Selective Supplement, что обеспечивает селективный рост сальмонелл. Посев инкубируют при 35 °С в течение 18-24 ч в аэробных условиях. Для идентификации сальмонелл культуру высевают на дифференциально-диагностические среды. Существенное сокращает продолжительность этапа неселективного обогащения исследование большого объема аликвоты культуральной среды (10 куб.см, а не 0,1 куб.см), а также повышенной буферной емкостью среды Salmosyst за счет высокого содержания карбоната кальция (10 г/л), который обеспечивает оптимальную для роста сальмонелл нейтральность среды (рН 7). Достоинства этого метода в том, что сокращается время исследования на 24-48 ч, высокая чувствительность, при которой выявляются даже поврежденные клетки сальмонелл, простота выполнения анализа и экономичность.

Экспресс-тесты выявления бактерий

Иммунохроматографические экспресс-тесты Singlepath®-Salmonella используют для сертификации пищевой продукции в микробиологических и независимых лабораториях. Принцип экспресс-тестов основан на реакции антигенов сальмонелл с высокоспецифичными антителами теста. После этапа селективного обогащения на среде Раппопорта–Вассилиадиса (RVS) аликвота обогащенной пробы (2 куб. см) термически инактивируется, после чего 0,16 куб.см вносят в лунку тест-планшета. Содержащиеся в пробе антигены сальмонелл взаимодействуют с моноклональными антителами экспресс-теста, образуя окрашенный комплекс антиген–антитело, выявляемый визуально. Результат считывают уже через 20 мин после внесения пробы. Если красная линия присутствует в тестовой (Т) и контрольной (С) зонах планшета, результат считают положительным, при ее присутствии только в С-зоне - отрицательным. При получении положительного ответа высевают культуральную жидкость на дифференциально-диагностические среды. Отрицательный ответ является окончательным и свидетельствует об отсутствии сальмонелл в анализируемом продукте. Таким образом, экспресс-тест Singlepath®- Salmonella позволяет выявлять сальмонеллы в образце сразу после этапа селективного обогащения, не прибегая к дополнительным пересевам на дифференциально-диагностические среды.

Экспресс-тест используют и как подтверждающий при идентификации характерных по морфологии колоний сальмонелл. Время исследования в этом случае также составляет 20 мин. Преимущество метода в значительном сокращении времени исследований, высокой специфичности и надежности определения. Метод не предусматривает сложных процедур пробоподготовки, использования каких-либо дополнительных приборов или устройств. В сфере пищевой микробиологии в последние годы все шире применяют методы молекулярно-генетического анализа, в частности метод ПЦР, в процессе анализа in vitro амплифицируется ДНК сальмонелл. Мишенью для амплификации служат специфичные фрагменты нуклеиновых кислот патогена. Принципиальная особенность применения метода Real-Тime PCR в том, что можно провести детекцию продуктов амплификации ДНК бактерии в динамике непосредственно в процессе проведения реакции. Анализ Real-Тime PCR проводится на амплификаторе, который выполняет циклы нагрева и охлаждения образца в заданном диапазоне температур и регистрирует флуюресценцию, соответствующую количеству образовавшихся ампликонов. Процедура ПЦР-анализа пищевой продукции по выявлению сальмонелл и других патогенных микроорганизмов регламентируется ГОСТ Р ИСО/МЭК-17025. Экспресс-метод выявления бактерий рода Salmonella с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (Real-Тime PCR) позволяет определять присутствие в них сальмонелл с высокой селективностью и чувствительностью. Метод включает 3 обязательных этапа - это неселективное обогащение исследуемого образца, которое позволяет исключить ложноположительные результаты при детекции ДНК нежизнеспособных клеток), пробоподготовку (экстракция ДНК из обогащенной культуры) и детекцию ДНК сальмонеллы в автоматическом режиме на термоциклере.

Кроме этого, система позволяет идентифицировать колонии сальмонелл с агаризованных сред в течение 2 ч. С помощью метода Real-Тime PCR, можно обнаружить сальмонеллы в анализируемом объекте по наличию их ДНК, то есть без выделения в чистой культуре. Метод обеспечивает автоматическую регистрацию результатов, характеризуется высокой производительностью, чувствительностью и селективностью. Однако для его реализации нужны значительные затраты средств на приобретение амплификатора, дополнительное обустройство аналитической лаборатории, повышенные требования к ее чистоте.

Источник: «ПищеПромЭксперт»